P18-08 : 環境水中に生息する自由生活アメーバ類の分子生物学的手法による検出

井上 浩章^1,2,縣 邦雄¹,太田 寛行²
1アクアス・つくば総研, 2茨城大・農
【目的】自由生活アメーバ類は環境中に広く生息しており，レジオネラ症の原因細菌であるレジオネラ属菌の宿主にもなる．そのため，環境水のレジオネラ汚染を抑制するためにはアメーバ類の抑制も必要で，アメーバ類の検出は重要である．アメーバ類の検出方法としては培養法が一般的だが，観察および同定には技能を要し，培養には2週間程度掛かるため容易ではない．そこで，培養法よりも迅速にアメーバ類を検出および同定するため，Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism（T-RFLP）法による検出を検討した．
【方法】冷却塔水から5種のアメーバ類（Acanthamoeba sp.，Naegleria sp.，Hartmannella sp.，Flamella sp.，Nuclearia sp.）を培養法（大腸菌塗布無栄養寒天培地）で単離した．そして，PrepMan Ultra（Applied Biosystems）でDNAを抽出し，18S rRNA遺伝子の一部をPCR増幅した．PCR産物は制限酵素処理してDNAシークエンサーでフラグメント解析した．また，冷却塔水から環境DNAを調整し，同様にT-RFLP解析した．
【結果および考察】T-RFLP解析において6種類の制限酵素を検討した結果，Fun4HIが最も解析に適し，上記5種のアメーバ類を迅速に検出できることが示された．また，冷却塔水の解析では，アメーバ類由来と判断される単離アメーバと類似のフラグメントが観測された．今後は共存する他の真核生物の影響を確認しながら，環境水からのアメーバ類検出方法の確立をめざす．

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