PK-194:

GeneFISH法を用いて富士山地下水を対象に脱窒細菌の機能遺伝子を シングルセルレベルで検出する試み

富士山の地下は大量の地下水を蓄えており，滞留時間はおよそ25〜35年とされている(Tosaki et al., 2011)．富士山周辺地域における地下水の硝酸汚染の問題は以前から指摘されてきたが，茶畑周辺での硝酸汚染は地下水の滞留時間の長さもあり，回復が課題となっている．このような硝酸汚染を改善するために現場環境中の微生物による脱窒機能を活用する方法がある．脱窒を担う脱窒細菌の活性や群集構成を明らかにする研究はこれまで多く行われてきたが，環境中に存在する脱窒細菌の正確な定量は難しい．硝酸汚染が進んだ富士山地下水中における脱窒活性の制限因子を明らかにするには，脱窒細菌の正確な定量が必要となる．そこで本研究では富士山地下水中の脱窒細菌を定量する方法として，顕微鏡下で特定の遺伝子を持つ細菌をシングルセルレベルで検出可能なgeneFISH法の適用を目指した．
GeneFISH法はMoraru et al. (2010)が発表した細胞内に存在する極めて少数の遺伝子を対象とし，ポリヌクレオチドプローブとチラミドシグナル増幅反応を組み合わせた遺伝子検出技術である．先行研究において対象とする特定の遺伝子の検出が報告されたが，その検出率は30%と低く，試料に合わせた細胞壁の処理が必要となる．本研究では地下水へのgeneFISH法の適用のため，モデル脱窒細菌として現場地下水中に存在するクローンに最も近縁な菌株を用いて，高感度で高精度にnirS遺伝子を検出するための手順の改良を試みた．特に細胞膜処理ではlysozymeとproteinase Kの2つの酵素を検討し，ハイブリダイゼーション反応ではプローブ濃度とホルムアミド濃度の検討を行った．モデル脱窒細菌Pseudomonas stutzeriを用いて細胞膜処理にproteinase K，ハイブリダイゼーション反応に20%ホルムアミドを用いて約60%のnirS遺伝子を検出することに成功した．
さらに現場の脱窒細菌群集の活性と数との関係を明らかにするために，属レベルで異なる脱窒細菌のnirS遺伝子を同時に検出する必要がある．多様なnirS遺伝子を網羅する複数のプローブを組み合わせることで地下水中に存在する脱窒細菌の高感度で高精度な定量が可能となるだろう．

keywords:硝酸汚染,脱窒,*nirS*遺伝子,geneFISH,,