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PI-147:

シングルセルレベルでのldhA発現のゆらぎと休止細菌形成の関連性

Posted On 06 10月 2015
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Comment: Off
Tag: IB: 界面/バイオフィルム(interface/biofilm), PM: 生理/代謝/増殖(physiology/metabolism)

一色 理乃1, 河合 祐人1, 松本 慎也1, 常田 聡1
1早大院・先進理工, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10

【目的】単一細菌種の集団中において、各細菌で増殖速度に不均一性がみられる。また、抗生物質は細菌の増殖を標的としているため、persister (休止細菌) と呼ばれる非増殖性の細菌はその作用から逃れることができる。休止細菌は、遺伝的な多様性ではなく表現型の変異により発生することが知られており、遺伝子発現解析が進められている。我々はこれまでに、大腸菌を用いて休止細菌を検出するマーカー株を作製した。そして、確率的に発生する休止細菌を分取し、その遺伝子発現を網羅的に解析した。その結果、休止細菌において嫌気環境下での代謝に関わる遺伝子の発現が上昇していた。本研究では、ldhA (lactate dehydrogenase A) に着目し、休止細菌の表現型である増殖抑制および抗生物質寛容性とldhA発現との関連性を解析することを目的とした。
【方法】休止細菌は細菌集団中で一部にしか現れないため、集団を一括りにした解析では休止細菌を解析することは困難である。そこで、ldhA発現を可視化し、発現したシングルセルの状態変化を追跡することにした。まず、ldhA発現を可視化するため、ldhAのプロモーター領域下流に蛍光タンパク質Venusを配置したプラスミドを作製し、大腸菌に導入した。続いて、シングルセルレベルでのタイムラプス観察のために、マイクロ流体デバイスを作製した。マイクロ流体デバイスには、細菌を固定する幅・厚さの小さい溝と培地や抗生物質を流す幅・厚さの大きい流路が設置されており、培地や抗生物質の供給を自由に変更しながら、生きた細菌の長時間観察が可能である。これらを利用し、ldhAを発現する大腸菌の増殖状態および抗生物質アンピシリン処理後の応答を観察した。
【結果・考察】ldhAの発現は確率的で、一部の細菌が一時的に強く発現することが明らかとなった。また、ldhAを発現した細菌は、発現していない細菌に比べて、増殖が抑制され、高濃度のアンピシリンに対して抵抗性を示すことが確認された。以上の結果から、ldhAの確率的な発現が休止細菌形成に関係していると示唆された。さらに、ストレスの無い環境下ではldhA発現は一過性であるのに対して、酸性ストレスを加えると長時間にわたる発現が見られた。同じ遺伝子でも、環境の違いにより発現様式を変化させていることが示唆された。

keywords:persister,ldhA,stochastic,,,

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